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上海亞榮旋轉蒸發儀在海帶硫酸化多糖的提取及純化中的應用

1.I實驗材料與儀器
(1)材料.原料為榮成市人工養殖廠的干海帶,D101大孔吸附樹脂(G藥集團化學試劑有限公司)D72型犬孔強酸性苯乙烯系鼷離子交換樹脂、D315弱堿縫苯乙烯系陰褰子交換辮脂、D296大孔強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂(南開大學化工廠),纖維索酶(150 000 U/g)、果膠酶(20 000 U/g)(上海藍季科技發展有限公司),考馬斯亮藍G-250(Fluka進口分裝),其它試劑均為G產分析純.(2)儀器與設備.高速組織搗攆撰l(DS-1蘩,上海標本模型廠),電熬逐瀑瘩洛鍶(◇K一98一l黧,金壇棗歪基儀器騫限公靄),離心撬
(TDL一5一A型,上海安亭科學儀器廠),旋轉蒸發器(RE52~99型,上海亞榮生化儀器廠),循環水式多用真空泵(SHB-Ill型,鄭州長城儀器廠),真空冷凍干燥機(Flexi—dry systems,Stone Ridge。NewYork。made inUSA),布氏灞斗,35 minx400 mm層斬柱,紫羚分光巍度計(3 300 RKD羹,索氏提取器).
1.2 LPS的粗提取
(1)酶提法提取LPS.準確稱取海帶,加入15倍的水,用高速組織搗碎機搗碎,依次加入纖維素酶0。25 g,果膠酶0。5 g,瀵勻,將pH籃漏**4.0,予40℃"-50℃水浴4 h,再升涅**80℃30 mim,使酶滅活,待冷卻后收集濾液,將濾渣水洗兩次合并濾液.所得濾液調pH值**7.0,經減壓蒸餾濃縮**原體積的l/4~1/5,5 000 r/min離心15 min去除不溶性雜質.上清液加無水乙醇**總體積的30%,靜置沉淀4 h,離心去除不溶物.上清液加無水乙醇**總體積的60%,低溫過夜沉淀多糖后離心,沉淀依次用無水乙醇、乙醚、丙酮洗數次,冷凍干燥得LPS粗品.(2)水提法提取LPS.準確稱取海帶,加入20倍的水,用高速組織搗碎機搗碎.然后在70℃水浴中抽提4 h,其它步驟與酶解工藝相同.
1.3 LPS的初步純化
(1)CTAB沉淀硫酸化多糖.將酶解法所提LPS粗品用適量蒸餾水溶解,加入2%的CaCl:靜置2 h,5 000 r/rain離心15 min去除粗糖液中殘留的褐藻膠,上清液加5%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉淀酸性硫酸多糖.沉淀用3%的KCl溶解后,用三倍體積的乙醇沉淀,5 000 r/min離心15 min,沉淀依次用無水乙醇、乙醚、丙酮洗數次,冷凍干燥.(2)大孔吸附樹脂脫色.取100 ml濃度為1%的粗多糖液加入1g處理過的樹脂,放人恒溫搖床,丁=30℃、120 r/rain、10 h,脫色后多糖液經雙層濾紙過濾后,測定色素吸光值及糖含量,計算實驗前后的溶液的脫色率及多糖回收率Is3,并對所選樹脂脫色效果的因素進行研究
1.4 LPS成分的測定
(1)多糖含量的測定.總糖含量測定采用蒽酮硫酸法[6],還原糖含量測定采用3,5一二硝基水楊酸(DNS)比色法[7],均用葡萄糖作為對照品做標準曲線.
(2)蛋白質含量的測定.采用考馬斯亮蘭比色法[8],以牛血清白蛋白做標準品繪制標準曲線.
(3)硫酸根含量測定.采用比濁法[9],以硫酸鈉做標準品繪制標準曲線.

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